تکنیک SDS-PAGE با کمک دستگاه الکتروفورز
تکنیک SDS-PAGE، روشی کم هزینه، بسیار سریع و قابل تکرار برای مطالعه پروتئین ها به شمار می رود که در آن از دستگاهی به نام الکتروفورز استفاده می شود. در این تکنیک به سبب وجود سدیم دودسیل سولفات و ژل پلی آکریل آمید، پروتئین ها با قدرت زیادی تفکیک می شوند. برای آشنایی بیشتر با این روش و مراحل انجام آن، توصیه می کنیم که این مقاله را تا انتها مطالعه کنید.
تکنیک SDS-PAGE با کمک دستگاه الکتروفورز
یکی از روش های کم هزینه، سریع و تکرارپذیر برای مطالعه و بررسی پروتئین ها تکنیک SDS-PAGE می باشد. روش SDS-PAGE برای تحلیل و بررسی مراحل خالص سازی و همچنین تعیین وزن مولکولی پروتئین ها مورد استفاده قرار می گیرد. از آنجایی که در این تکنیک از ماده سدیم دودسیل سولفات (SDS) و ژل پلی آکریل آمید استفاده می شود؛ این تکنیک قدرت فوق العاده بالایی برای تفکیک پروتئین ها دارد.
SDS به نوعی دترجنت آنیونی گفته می شود که به نواحی هیدروفوب پروتئین ها متصل شده و باعث دناتوره شدن آنها می شود. به عبارت دیگر بر اثر اتصال مولکول SDS به پروتئین ها، با طبیعی پروتئین ها پوشیده شده و یک توزیع یکنواختی از بارهای منفی بر روی آن شکل می گیرد که بر اثر این اتفاق مولکول های پروتئین ها با توجه به وزن مولکولی آنها جداسازی می شوند.
برای اینکه مولکول های پروتئین ها خطی شوند، در این روش آنها را در مقداری SDS و ماده احیا کننده ای به نام مرکاپتو اتانول قرار می دهند تا باند های دی سولفیدی از بین بروند. مقدار SDS مورد نیاز برای اتصال به هر گرم پروتئین، ۱٫۴ گرم می باشد که بعد از ران کردن دستگاه الکتروفورز، پروتئین ها با توجه به وزن مولکولی خود از یکدیگر جداسازی می شوند. بدین معنا که هرچه اندازه مولکول بزرگتر باشد، حرکت آن به دلیل اصطکاک با محیط اطراف کمتر خواهد بود.
ساختار مولکول SDS به نحوی بوده که به قندها متصل نمی شوند، بنابراین آن دسته از پروتئین های که بخش قندی بزرگتری دارند، با توجه به وزن مولکولی خود SDS کمتری را جذب خواهند کرد که این موضوع باعث حرکت کندتر آنها بر روی ژل و در نتیجه تخمین وزنی بیشتر از وزن واقعی شان می شود.
تاثیر ژل پلی آکریل آمید در تکنیک SDS-PAGE
در تکنیک SDS-PAGE با کمک دستگاه الکتروفورز، ژل پلی آکریل آمید نقش بسیار تعیین کننده برای تفکیک و جداسازی پروتئین ها از یکدیگر دارد. دامنه وزنی قابل تفکیک در SDS-PAGE با توجه به قطر منافذ موجود در این ژل مشخص می شود که قطر این منافذ بستگی به غلظت دو جزء سازنده آن (C % , T %) دارد.
تکنیک SDS-PAGE در شرایط احیایی و غیر احیایی
برای شکل گیری ساختمان های سوم و چهارم پروتئین ها، پیوندهای دی سولفیدی درون و با بین زنجیره ای نقش بسیار مهم و تعیین کننده ای را ایفا می کنند. اگر این پیوند ها به کمک مواد تیول دار احیا شوند، ساختمان های سوم و چهارم پروتئین ها به طور کامل از بین می روند. در هر کدام از شرایط احیایی و غیر احیایی دستگاه الکتروفورز، پروتئین هایی که حاوی پیوند دی سولفیدی هستند، از حرکت های متفاوتی برخوردار می باشند که احیای آنها باعث جداسازی زیر واحدهای پروتئینی در پروتئین هایی می شوند دارای چند زیر هستند.
علاوه بر این، احیا شدن پیوندهای دی سولفیدی، تمام پروتئین ها را خطی کرده، که بر اثر آن SDS ها و پروتئین ها به صورت یکنواخت به یکدیگر متصل می شوند. از این رو با مطالعه و مقایسه الگوی الکتروفورز در شرایط احیایی و غیر احیایی، اطلاعات زیادی در رابطه با ساختار سوم پروتئین ها به دست می آید.
سیستم بافری در روش SDS-PAGE
ژل پلی آکریل آمید مورد استفاده در تکنیک SDS-PAGE خود از ۲ ژل متراکم کننده و جداکننده تشکیل شده است که محل قرار گیری ژل متراکم کننده در بالا بوده و موادی متفاوت از مواد ژل جداکننده دارد. از آنجایی که در ژل متراکم کننده، بار الکتریکی پروتئین ها از تراک یکسانی برخوردار است، باعث می شود که همگی به با سرعت یکسانی حرکت کنند و شبیه به یک لایه نازک به نظر برسند.
زمانی که مجموعه پروتئینی به نقطه ابتدایی ژل جداکننده نزدیک می شود، فرایند جداسازی پروتئین ها با توجه به وزن مولکولی آنها آغاز می شود. لازم به ذکر است که امروزه پرکاربردترین سیستم بافری در روش SDS-PAGE، بافر تریس-گلیسین می باشد. در سیستم های بافری، PH بافر در نمونه، ژل، مخازن و ترکیب های یونی با یکدیگر تفاوت دارند.
فرآیند آماده سازی نمونه در روش SDS-PAGE
فرایند آماده سازی نمونه در این روش به صورت زیر می باشد:
· اضافه کردن بافر نمونه با یک نسبت معین به بافر نمونه
· قرار دادن بافر نمونه در آب جوش برای مدت چند دقیقه (در این مرحله پروتئین دناتوره می شود.)
· برای اشباع پروتئین ها نسبت بافر به پروتئین باید ۳ به ۱ باشد.
· قرار گرفتن نمونه در ته چاهک بر اثر وجود ساکارز و با گلیسرول