مقایسه‌ دو روش مولکولی PCR و LAMP

در این مقاله قصد داریم دو روش مولکولی واکنش زنجیره ای پلیمر یا PCR و روش تکثیر همدمای DNA وابسته به حلقه  [Loop- Mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP)] را با یکدیگر مقایسه کنیم. امروزه در خیلی از آزمایشگاه ها از هر دوی این روش ها استفاده می شود.

روش مولکولی واکنش زنجیره ای پلیمر یا PCR

روش مولکولی (PCR (Polymerase Chain Reaction  که یک روش ساده و کارآمد است، در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس ابداع شد. در این روش مقادیر جزئی و کم DNA یا RNA  را به قدری افزایش می دهند که بتوان آنها را در آزمایشگاه مشاهده نمود. در این روش قطعه مناسبی از DNA بدون استفاده از سلولهای زنده تکثیر می شود. این روش قادر است تعداد نسخه اندکی از  dna هدف را تا سطحی که توسط ژل الکتروفورز قابل تشخیص باشد تکثیر نماید. این روش که در دهه های اخیر مورد استقبال دانشمندان علوم زیستی قرار گرفته است، یک روش بسیار سریع و حساس است.

روش مولکولی PCR سه مرحله اصلی دارک که شامل دناتوراسیون، پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی و مرحله پليمريزاسيون يا سنتز می شود. در مرحله دناتوراسیون به مدت ۳۰ ثانیه DNA  را با درجه ۹۴ سانتیگراد حرارت می دهند. در مرحله پرایمر در دمای ۳۰ تا ۶۵ درجه و به مدت ۳۰ ثانیه انجام می شود. مرحله سنتز توسط نوکلئوتید تری فسفات هایی که محلول هستند، انجام می‌شود.

روش مولکولی تکثیر همدمای DNA وابسته به حلقه  [Loop- Mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP)]

روش LAMP  در سال ۲۰۰۰ توسط نوتومی و همکارانش معرفی شد.  در این روش DNA با کارایی و سرعت بالا در یک دما تکثیر می شود. در این روش از چهار پرایمر یعنی دو پرایمر داخلی و دو پرایمر خارجی استفاده می شود. در این روش کل فرایند تکثیر تحت یک دما و به شکلی پیوسته صورت می گیرد. نتیجه روش LAMP بر روی ژل آگارز به شکل نردبانی مشاهده می شود.

مقایسه دو روش مولکولی PCR و LAMP

در روش PCR صفحاتی از ژنوم هر موجود زنده کپی برداری و تکثیر می شود.  سپس می توان آن ها را از طریق الکتروفورز مشاهده نمود. روش PCR مزایای بسیاری دارد.  به عنوان مثال این روش از چرخه های حرارتی به تعداد ۳۰ تا ۴۰ چرخه جهت تکثیر بهره می برد. در این روش نمونه ها یکروزه بررسی می شوند و انجام کار خیلی سخت نیست.

دستگاهی که در این روش از آن استفاده می شود ترموسایکلر نام دارد که قیمت بالایی دارد و تهیه کردن آن هزینه بر است. روش آشکارسازی و تشخیص محصول PCR عمدتاً با مشکلاتی نظیر استفاده از مواد سمی و خطرناک مثل برومیداتیدیم همراه است. این مشکلات باعث شده است که نتوان در همه جا از این روش استفاده کرد نیاز به آزمایشگاه‌های مجهز و افراد متخصص و تجهیزات مناسب است.

مزایای روش مولکولی  LAMP

اما روش جانشین PCR  که در سال ۲۰۰۰ ارائه شد روش LAMP، نیازی به چرخه های دمایی پیوسته ندارد. این روش تک دما است و در دمای ۶۰ الی ۶۵ درجه انجام می شود. روش مولکولی PCR  نیاز به تجهیزاتی مانند ترموسایکلر و الکتروفورز دارد اما در روش LAMP  این تجهیزات نیاز نیستند و بنابر کار خصوصا در شرایط بحرانی و آزمایشگاه های کمتر تجهیز شده سریع تر صورت می گیرد. معرف هایی که برای تشخیص در این روش مورد استفاده قرار می گیرند گرانقیمت نیستند و نیاز به دستکاری آزمایش ها در مراحل بعدی نیست. همچنین الگوی تکثیر در روش LAMP با روش PCR  متفاوت است. در روش LAMP از رنگ های واکنش دهنده با DNA استفاده می شود، که یکی از برتری های این روش نسبت به روش PCR  است.

حساسیت روش LAMP  در برخی مقادیر DNA  بیشتر از روش PCR است.   گزارش ها تا حدود ۱۰ برابر حساسیت بیشتر را نیز نشان داده‌اند. به علت وجود پرایمرهای با تعداد زیاد، اختصاصیت این روش بالاتر از PCR  است تداخلات کمتری صورت می‌گیرد. همچنین در روش LAMP برخلاف روش PCR این امکان برای آزمایش گر مهیاست که از مواد به طور مستقیم نمونه را استخراج کند و نیازی به شرایط ایزوله از اسیدهای نوکلئیک نیست.

برای تشخیص میکروارگانیسم ها از روش LAMP  استفاده می شود چرا که با توجه به شرایط نفوذ پذیری کم،  درجه حرارت پایین و هم دما بودن این روش آسیب کمتری به باکتری نسبت به روش PCR  وارد می شود. ازاین روش برای تشخیص باکتری های گرم مثبت و گرم منفی استفاده می‌شود. یکی از مهمترین تفاوت های این دو روش  در هزینه‌های استفاده از آنهاست. روش PCR به خاطر دستگاه ترموسایکلر و نیاز به آزمایشگاه مجهز قیمت بسیار بالاتری نسبت به روش LAMP  دارد. روش LAMP سریعتر و ارزان تر انجام می شود. با توجه به این تفاوت ها می توان از روش LAMP در تشخیص طیف وسیعی از عوامل بیماری زا استفاده کرد.