کالیبراسیون دستگاه ترموسایکلر جهت بررسی تنوع ژنتیکی

دستگاه های بسیاری وجود دارند که با آنها می توانیم آزمایش هایی جهت تشخیص نوع و تنوع ژنتیکی انجام دهیم. یکی از این دستگاه ها،‌ دستگاه ترموسایکلر یا Thermocycler  یا Thermal Cycler است که با استفاده از آن می توان به تکثیر DNA و نمونه های RNA با استفاده از فرآیند واکنش زنجیره ای پلیمراز پرداخت. دستگاه ترموسایکلر همانطور که از نام آن مشخص است با افزایش و کاهش دمای نمونه ها منجر به واکنش هایی برای ادامه آزمایش می شود. با افزایش نیاز به کالیبراسیون ترموسایکلرها، تعداد بیشتری از گروه ها در مورد چگونگی کالیبراسیون دستگاه ترموسایکلر مشاهده می شود. در اینجا چند روش کالیبراسیون دستگاه ترموسایکلر بیان می شود.

کالیبراسیون با تقلید از پروتکل PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز)

از دیدگاه زیست شناس مولکولی، بهترین روش برای کالیبراسیون دستگاه ترموسایکلر، با تقلید از روش PCR است. به عبارت دیگر، لوله ها را در تمام چاه های بلوک قرار داده، آنها را با ترکیب واکنش پر کرده و حسگرها را در آن قرار دهید، درب های لوله را بسته، بستن درب گرم گرمایی را ببندید و پروتکل PCR را که معمولا در آزمایشگاه استفاده می شود، اجرا کنید. این در شرایط خاصی به دمای واقعی درون یک لوله خاص که با یک ترکیب واکنش خاص در یک پروتکل خاص PCR در یک وسیله خاص پر شده است، نزدیک می شود. این تعبیر در حال حاضر ضعف عمده روش را نشان می دهد که در آن نمی توان به طور استاندارد مورد استفاده قرار گیرد. برای هر ترکیبی از لوله، مخلوط، پروتکل و ابزار این کالیبراسیون باید تکرار شود و نیاز به یک حجم کاری بسیار زیاد دارد و نتایجی را تولید می کند که نه می تواند با یکدیگر و نه با هر نوع استاندارد و نه به مشخصات تولید کننده دستگاه ترموسایکلر مقایسه شوند.

علاوه بر این، در این روش از کالیبراسیون متغیرهای بسیاری که کنترل نشده اند معرفی می شوند و در نتیجه بخش بزرگی را به عدم قطعیت اندازه گیری را اضافه می کنید، که با عدم قطعیت بیش از  ° C 2 پایان می یابد. در عمل، زمانی که عدم قطعیت برای مثال ۲ درجه سانتی گراد باشد در حالی که اندازه گیری ۹۶ درجه سانتی گراد، درجه حرارت ترموسایکلر می تواند در هر نقطه بین ۹۴ درجه سانتی گراد و ۹۸ درجه سانتی گراد باشد.  این تفاوت در درجه حرارت تاثير زيادی بر فعال شدن پلیمراز تاک دارد. بنابراین این عدم قطعیت برای کالیبراسیون دستگاه ترموسایکلر قابل قبول نیست، اگر چه پیروی از روش PCR ممکن است انتخاب ساده و جذابی باشد.

کالیبراسیونی که نماینده روش PCR است

از یک دیدگاه شیمیدان یا داروساز بالینی، بهترین روش برای کالیبراسیون دستگاه ترموسایکلر، اندازه گیری به یک روش استاندارد است که نماینده پروسه PCR است. این روش استاندارد اجازه می دهد تا یک کالیبراسیون برای تمام انواع مختلف PCR ها  استفاده شود و همچنین امکان مقایسه آن با یک استاندارد را فراهم می کند. علاوه بر این، تعدادی از دماهای مختلف، ترجیحا نزدیک به دمای دناتوراسیون، بازپخت و کشیدگی، باید ارزیابی شود زیرا این اثرات می تواند با درجه حرارت تغییر کنند.

کالیبراسیون مطابق با استانداردهای بین المللی است

از دیدگاه meteorologist، بهترین راه برای کالیبره کردن دستگاه ترموسایکلر اندازه گیری به شیوه ای تعریف شده و قابل ردیابی توسط افراد متخصص، در شرایط محیطی تعریف شده است، با کمترین عدم قطعیت اندازه گیری دست یافتنی و شناخته شده، به استثنای متغیرهای فاقد کنترل در صورتی که ممکن است. در مترولوژی، کالیبراسیون به عنوان مجموعه عملیاتی تعریف می شود که در شرایط خاص مشخص می شود که رابطه بین مقدار مقادیر نشان داده شده توسط یک ابزار اندازه گیری یا سیستم اندازه گیری یا مقادیر نشان داده شده توسط یک مقدار مواد و مقادیر مربوطه که توسط یک مرجع استاندارد بین المللی قابل ردیابی است. قابلیت ردیابی با استفاده از استانداردهای مرجع قابل ردیابی بین المللی و بیان ارزش های کالیبراسیون در دستگاه SI تضمین شده، بلکه با عدم قطعیت محاسبه کالیبراسیون انجام شده است. عدم قطعیت باید از نظر فنی کم باشد.

مطمئن ترین روش کالیبراسیون دستگاه ترموسایکلر

برای تعیین کالیبراسیون، مطابق با استاندارد ISO 17025 و نماینده فرایند PCR، تعدادی از معیارها باید رعایت شود. کالیبراسیون باید:

• اندازه گیری تمام ویژگی های حرارتی که بر نتایج یک PCR تاثیر می گذارند، از جمله دقت، یکنواختی، میزان بیش از حد / کم، نرخ گرما / سرما و زمان نگهداری
• به روش پویا انجام می شود، به عنوان مثال PCR یک روند پویا است و نه استاتیک.
• به طور همزمان با چند کانال اجرا  شود تا اثرات زمانی بین چاه ها را حذف کند.
• تحت شرایط محیطی کنترل شده انجام شود.
• توسط پرسنل واجد شرایط و آموزش دیده انجام شود.
• قابل ردیابی طبق  ITS-90 و بیان مقادیر کالیبراسیون در واحد SI با یک عدم اطمینان محاسبه شده باشد.