الکتروفورز دستگاهیست که در علم پزشکی به تجزیه و تفکیک عناصر کمک می کند و برای تشخیص DNA بسیار کارآمد است و انواع مختلف آن در بازار موجود است که الکتروفورز افقی ژل پلی آکریل آمید از بهترین این دستگاه ها است ولی چون روش این دستگاه پیچیده و گران قیمت است باید تلاش شود تا روش های به صرفه تر و با دقت بالاتری ساخته شود.
الکتروفورز (Electrophoresis) چیست؟
زمانی که ذرات در یک میدان الکتریکی حرکت می کنند، می گویند الکتروفورز رخ داده است. در الکتروفورز بعضی از مولکول ها که دارای بار هستند همانند DNA یا پروتئین یا اسیدهای نوکلئیک با توجه به بعضی از مشخصه های فیزیکی مانند وزن مولکولی و بار الکتریکی و … از یکدیگر جدا می شوند که در نتیجه شناسایی قطعات تشکیل دهنده آنها را برای ما بسیار آسان می کند. در ادامه به معرفی چند نوع از الکتروفورز ها می پردازیم.
الکتروفورز ژل
در الکتروفورز افقی یا عمودی به یک فاز ثابت نیاز داریم لذا از ژل، که یک محیط نیمه جامد است استفاده می کنیم. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می گویند چرا که ساختار ماده را از هم جدا و بر اساس طول تفکیک می کند. ژل ها به دو نوع ژل پلی آکریل آمید (PAGE) و ژل آگاروز تقسیم می شوند. برای تفکیک پروتئین ها و اسید نوکلئیک ها ژل پلی آکریل آمید مؤثرتر است که هر چه غلظت آن بیشتر، امکان تفکیک هم بیشتر خواهد بود. البته اگر در الکتروفورز افقی ژل پلی آکریل آمید بخواهید تفکیک بر حسب وزن مولکولی صورت گیرد؛ باید مادۀ SDS یعنی سدیم دودسیل سولفات به ژل اضافه کنید چرا که بار منفی آن موجب می شود SDS به اسیدهای آمینه بچسبد و لذا یک بار منفی متناسب به وزن مولکولی به پروتئین القا شود. از ژل پلی آکریل آمید برای تفکیک قطعات ریز DNA های دو رشته ای و تک رشته ای نیز استفاده می کنند. از ژل آگاروز برای بررسی کیفی و تفکیک ماکرو مولکول های DNA (بزرگتر از ۵۰۰ جفت باز) استفاده می شود. البته از الکتروفورز افقی ژل آگاروز نیز برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود که این روش بسیار ساده تر و کم هزینه تر خواهد بود.
الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی
یکی دیگر از شیوه های الکتروفورز افقی تحت میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی است که به سهولت انجام می شود. در این روش از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی استفاده می شود که در آن یک میدان الکتریکی برقرار می کنند که در یک تناوب معین قطع و وصل می شود. زمانی که میدان وصل است مولکول DNA هم جهت با میدان حرکت می کند و به شکل گسترده در می آید. و زمانی که قطع است، حرکت مولکول DNA متوقف می شود در این هنگام مولکول DNA فرصت پیدا می کند تا به شکل خاص خود در بیاید ولی برای این امر فرصت کافی برای همه مولکول ها نیست چرا که میدان الکتریکی الکتروفورز افقی دوباره متصل می شود و مولکول دوباره به جریان می افتد. در این میان مولکول های کوچکتر شانس بیشتری برای رسیدن به شکل فضایی و خارج شدن از آن دارند. با استفاده از همین روش در الکتروفورز افقی در میدان الکتریکی مولکول هایی بزرگ تا اندازه ۴۰۰ کیلو جفت باز را می توان از هم جدا کرد.
الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس (FIGE)
در روش FIGE، جهت میدان الکتریکی در یک دوره تناوب معین، قطب ها برعکس می شوند. همچنین تفاوت دیگر آن استفاده از دامنه های کوچک زمانی است. این میدان الکتریکی بطور متناوب به مدت ۵/. ثانیه در جهت مستقیم و به مدت ۲۵/. ثانیه در جهت دیگر ایجاد می شود. البته در الکتروفورز افقی / عمودی برای مولکول های بزرگ تر از زمان های ۳ ثانیه در جهت مستقیم و ۱ ثانیه در جهت مخالف استفاده می کنند. در این روش مولکول ها تا اندازه ۸۰۰ کیلو جفت باز از هم تفکیک می شوند.
الکتروفورز افقی و عمودی
در روش های معمول الکتروفورز عمودی پلی اکریل آمید تزریق ژل و ایجاد شدن حباب در راه حرکت DNA کار را برای مصرف کننده سخت می کرد همچنین عموماً برای جلوگیری از تشکیل حباب با زدن ضربه به سطح شیشه ژل را به سمت پایین جهت دهی می کردند لذا گاهی در الکتروفورز عمودی زمان کافی برای تزریق ژل وجود نداشت در نتیجه ژل درون سرنگ یا ظرف بسته می شد. همچنین در بسیاری از موارد در روش های الکتروفورز عمودی هنگام جدا کردن شیشه ها و رنگ آمیزی احتمال پارگی ژل زیاد است. در روش الکتروفورز عمودی تجهیزات، اقلام اختصاصی و هزینه های زیادی لازم است و پیچیده بودن الکتروفورز عمودی مهارت زیادی را می طلبد. لذا گاهی الکتروفورز افقی مفیدتر، ساده تر و حتی بهتر عمل می کند. در الکتروفورز افقی سینی ژل تانک الکتروفورز به صورت افقی قرار گرفته است. روش الکتروفورز افقی را اولین بار بریگام و همکارانش ابداع کردند و تا اکنون روش های مختلفی برای الکتروفورز افقی پلی اکریل آمید ابداع شده است. در این روش مواد شیمیایی ژل مربوطه به سطح شیشه ای می چسبند و ادامه الکتروفورز افقی بر روی آن اعمال می شود.
کاربرد الکتروفورز در پزشکی
- تخمین اندازه مولکول های DNA بعد از برش با آنزیم های محدودالاثر. به عنوان مثال نقشه یابی DNA کلون شده بعد از در معرض آنزیم های محدودالاثر قرار گرفتن
- آنالیز محصولات PCR: به عنوان مثال استفاده در تشخیص ژنتیک و یا Genetic fingerprinting
- جداسازی قطعات DNA برای استخراج و تخلیص
- جداسازی DNA ژنومی بریده شده قبل از انتقال ساترن و یا برای RNA قبل از انتقال نوردرن (Northern blotting)
- الکتروفورز افقی همچنین برای تشخیص و انتقال پلاکت سازگار در پیوند عضو، تشخیص تشابه گروه خونی و RH بین اهدا کننده و دریافت کننده استفاده می شود. که اگر تجانس بین آنتی ژن های HLA وجود نداشته باشد گیرنده پیوند را پس می زند.