نحوه انجام آزمایش ایزوالکتروفوکوسینگ

در محیط های آزمایشگاهی برای جداسازی مولکول ها از تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ استفاده می شود. در واقع عمل جداسازی انواع مولکول ها را می توان با استفاده از نقطه ایزوالکتریک انجام داد. این عمل را با هدف استفاده از عملکرد بار مولکولی که نشانگر تابعی از PH محیط اطراف است انجام می دهند.

مهم ترین کاربرد ایزوالکتروفوکوسینک

بیشترین و مهم ترین کاربردی که می توان برای تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ در نظر گرفت، در زمینه مطالعات پروتدین هاست. در واقع با استفاده از روش الکتروفوکوسین و بر اساس محتوای آمینواسیدی پروتئین ها می توان آن ها را جداسازی نموده و پروتئین ها را در یک شیب تثبیت شده PH که شامل نشاسته، آگارز و  پلی اکریل آمید می باشد؛ قرار می دهد. امروزه ایزوالکتروفوکوسینگ را نخستین گام در الکتروفورز ۲ بعدی می دانند که طی این روش پروتئین ها در ابتدای امر بر اساس PH جدا شده و در مرحله بعد با استفاده از روش SDS-PAGE می توان آن ها را بر اساس وزنشان از یکدیگر جدا نمود. لازم است بدانید روش ایزوالکتروفوکوسینگ پروتئین هایی را از یکدیگر جدا می کند که تفاوت آن ها PI/ 0.01 باشد.

استفاده از تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ

ایزوالکتروفوکوسینگ را نوعی الکتروفورز ناحیه ای می دانند که بر روی پروتئین های موجود در ژل اعمال خواهد شد. در این روش محلول آمفولیت ها را به ژل هایی می افزایند که دارای شیب PH تثبیت شده  (IPGs)هستند. IPG در این ژل ها همان ماتریکس آکریل امید پلیمریزه شده با شیب PH است که به عنوان عاملی مهم برای ایجاد شیب های کاملاً پایدار شناخته می شود. البته فراموش نکنید که این امر درباره PH هایی که شدت قلیایی آن ها بالاست صدق نخواهد کرد. در این عملکرد شیب PH بدست آمده در شیب غلظتی تثبیت شونده ها که نوعی اسید یا باز ضعیف می باشند و میزان PK آن ها را تعریف می کند، تغییر یکنواختی ایجاد نموده و در نهایت منجر به ایجاد شیب PH در شیب غلظتی این تثبیت شونده ها خواهد شد.

نحوه عملکرد ایزوالکتروفوکوسینگ در جداسازی پروتئین ها

 اما داشتن PH کمتر از نقطه ایزوالکتریک خود توسط پروتئین نشانگر این است که آن پروتئین باری مثبت دارد و به همین دلیل به سمت کاتد حرکت می کند. جابجایی PH در یک شیب افزایشی موجب کاهش بار کلی پروتئین شده تا جایی که این میزان بار، که هم اکنون به عنوان بار خالص شناخته می شود در نقطه ایزوالکتریک به صفر می رسد. این عمل که نتیجه اش تخلیه ی بار پروتئین می باشد سبب می شود تا پروتئین به دلیل نداشتن بار در میدان از حرکت بایستد و در یک نقطه باند شارپ تشکیل بدهد. جالب است بدانید از آنجایی که PH هر پروتئین مانند اثر انگشت تنها مختص اوست؛ لذا هر پروتئینی در نقطه ایزوالکتریک باند شارپ مخصوص خود را خواهد ساخت.

ایزوالکتروفوکوسینگ در ژل پلی اکریل آمید لوله ای

نوع لوله ای ایزوالکتروفوکوسینگ یا همان IEF از جمله اشکال ساده و ابتدایی تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ می باشد و امروزه در بسیاری از مراکز تحقیقاتی و تشخیصی مورد استفاده قرار می گیرد. استفاده از ژل پلی اکریل آمید که غلظتی بین ۳ تا ۵ درصد داشته و قطر آن چیزی حدود ۱ الی ۲ میلی متر باشد در این روش الزامی است. اهداف مختلفی برای استفاده از ایزوالکتروفوکوسینک درون تانک تیوب ژل وجود دارد، به طور مثال می توان از آن برای بررسی اجزای پروتئین ها، میزان خلوص آن ها و همچنین مشخص نمودن نقاط ایزوالکتریک استفاده نمود. برای تفکیک پروتئین ها، اگر ایزوالکتروفوکوسینگ به عنوان بعد اول در تانک تیوب ژل قرار بگیرد؛ می توان گفت از تکنیک الکتروفورز دو بعدی به روش اوفارل استفاده شده است. اما چون نمونه های پروتئینی اغلب شامل نمونه بافت یا سلول هستند بهتر است برای تفکیک آن ها به روش مطلوب تر، IEF را در شرایط دناتوره کننده انجام داد.

مواد مورد نیاز برای ایزوالکتروفوکوسینگ

برای تهیه مواد مورد نیاز در انجام ایزوالکتروفوکوسینگ باید محلول استوک را که درصد T آن ۳۰ و درصد C آن ۳ باشد با ۲۹٫۱ گرم اکریل آمید، ۰٫۹ گرم بیس اکریل آمید و همچنین اکریل امید مخصوص IEF مخلوط و آن ها را زیر هود وزن کرده و با ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر ترکیب نمایید. لازم است بدانید برای ماندن این محلول تا حداکثر ۳ هفته می توانید آن را در ظرفی تیره و درون یخچال نگهداری کنید.

از دیگر مواد لازم جهت این آزمایش می توان به آمفولیت، فارمالیت یا مخلوطی از هر دو باPH  ۵ تا ۱۰، اوره با درجه خلوص بالا، پرسولفات آمونیوم ده درصد که میزان ۰٫۱ گرم آن در ۱ میلی لیتر آب مقطر به صورت تازه حل شده باشد. ۰٫۱ میلی گرم TEMEDده درصد که به تازگی در ۰٫۹ میلی لیتر آب مقطر حل شده باشد. بافر پوشاننده یا همان بافر نمونه که دوبار با آب مقطر رقیق شده باشد، اتیلن گلایکل با درجه خلوص بالا، آنولیت که شامل اسید فسفریک ۰٫۰۱ مولار باشد، کاتولیت که شامل محلول هیدروکسید سدیم ۰٫۰۱ مولار باشد، مارکرهای PI، دتر جنت NP-40 (محلول استوک ۲۰%) یا چپس اشاره نمود.

روش تولید بافر نمونه در آزمایش ایزوالکتروفوکوسینگ

برای تولید بافر نمونه (بافر تریس – HCL02 مولار با PH/ 7.5که حاوی ۹ مولار NP-40 4 درصد و آمفولیت ۴ درصد) باید ۵٫۴ گرم اوره را با ۲ میلی لیتر NP-40 و ۰٫۴ میلی لیتر آمفولین مخلوط کرده و در بافر تریس تا حجم نهایی ۱۰ میلی لیتر حل کنید. در نهایت باید چند کریستان برموفنل بلو به این ترکیب اضافه نموده تا محلول به شکل آبی رنگ درآمده و آماده استفاده شود.

روش آزمایش ایزوالکتروفوکوسینگ

برای انجام آزمایش ایزوالکتروفوکوسینگ باید قبل از هر چیز لوله های تانک تیوپ ژل را کاملاً شسته و خشک کنید. سپس آن ها را در جا لوله ای به صورت عمودی بچینید. تمیزی لوله ها باید طوری باشد که به راحتی بتوانید ته آن ها را توسط پارافیلم ببینید. ۱۰ میلی لیتر محلول ژل با غلظت ۴٫۲ ٪ را تهیه نموده و به دورن یک سرنگ بکشید. سر سرنگ را درون لوله ها قرار داده و لوله ها را تا جایی که ۲ سانتی متر سرشان خالی باشد از این محلول پر کنید. یک ساعت منتظر بمانید تا ژل درون لوله ها منعقد شود. سپس ته لوله ها را تک تک باز کرده و آن ها را در دستگاه الکتروفورز تیوپ ژل قرار دهید. مقداری کانولیت در مخزن بالایی ریخته، سپس مخزن پایین را نیز با آنولیت پر کنید.

از ده دقیقه جلوتر دمای گردشی آب را روی درجه ۱۵ سانتی گراد بگذارید. حالا مرحله ی پیش فوکوشینگ را با شدت جریان یک میلی آمپر برای هر لوله و در زمانی ۲۰ تا ۳۰ دقیقه ای انجام دهید. سپس بعد از اینکه جریان برق را قطع نمودید شروع به نمونه گذاری کنید. الکتروفوکوسینگ را با ۶۰۰ ولت در ۸ الی ۱۰ دقیقه انجام داده و سپس ۱ ساعت با میزان ۸۰۰ ولت همین کار را انجام دهید. زمانی که عمل الکتروفورز تمام شد و لوله ها را از دستگاه بیرون آورید می توانید ژل آن ها را با فشار آب مقطر از سرنگ بیرون آورید.