ویژگی‌های برتر الکتروفورز دو بعدی

در بسیاری از روش‌ها و تجارب علمی، از جمله بررسی نوع عملکرد ژن‌ها، هویت پروتئین‌ها بسیار مهم تلقی می‌ شود. الکتروفورز دو بعدی، یکی از رایج‌ ترین و بهترین روش‌های جداسازی پروتئین‌ها می‌ باشد. امکان تکرار پذیری بالا از اصلی‌ترین نکات برجسته در این روش می‌ باشد.

الکتروفورز دو بعدی، تکنیکی برای جداسازی پروتئین‌ها بر اساس ویژگی‌های نقطه ایزوالکتریک و اندازه آنها می‌ باشد. در این روش ابتدا با روش ایزوالکتریک فوکوزینگ، پروتئین‌ها از هم جدا می‌ شوند. در واقع با استفاده از ولتاژ بالا و همچنین توزیع آمفولیت‌ها بر روی ژل، ژلی با گرادینت PH با استفاده از محلول آمفولیت‌ها تهیه می‌شود. در این جا یک ژل با میزان مختلف  PH در مکان‌های مختلف ژل به وجود می‌ آید. در این مقطع محلول پروتئینی مورد نظر، به ژل افزوده می‌شود و تحت ولتاژ بالا الکتروفورز صورت می‌ پذیرد.

در سال ۱۹۳۷ روشی برای جدا کردن الکتروفورتیک پروتئین‌ های سرم ابداع شده. پس از آن دستگاهی نیز برای انجام عملی این کار نیز، به وجود آمد. این کار به علت مهم بودن بررسی پروتئین‌های سرم، صورت پذیرفت. پس از آن عمده‌ترین پژوهش‌های ثمر یافته بر این موضوع، در سال ۱۹۴۰ به ثمر نشست. در واقع، در سیستم‌های نوری دستگاه، تفکیک قدرت ارتقا یافت. به طوری که تخمین کمی برای الگوهای الکتروفورز پروتئین‌های سرم، امکان پذیر گشت. نقطه اوج و مهم در روند الکتروفورز دو بعدی، در دهه‌های چهل و پنجاه صورت پذیرفت. در این زمان روش ایزوالکتروفوکوسینگ نیز ابداع گردید. به کمک این موارد، امکان انجام آنالیزهای جداسازی سه‌گانه بر روی مخلوط های پروتئینی به صورت جدا و یا ترکیبی، به وجود آمد. اولین تجربه رسمی الکتروفورز دو بعدی در سال ۱۹۵۶ انجام پذیرفت. در این تجربه، پروتئین‌های سرم با استفاده از الکتروفورز بر روی کاغذ و همچنین بر روی ژل نشاسته، از یکدیگر تفکیک شدند.

 در این تکنیک، بر اساس PH و حرکت پروتئین‌ها، جداسازی انجام می‌شود. در واقع پروتئین‌ها شروع به حرکت بر روی ژل می‌ کنند. هرگاه یک پروتئین به  PH رسید که برابر با نقطه ایزوالکتریک خودش باشد، حرکت پروتئین متوقف می‌ شود و در همان جا ساکن می‌ گردد. در بار دوم، تکنیک جداسازی، بر اساس وزن می‌ باشد. به همین منظور ژن حاصل را به روی ژل پلی آکریل قرار می‌ دهند. در این مرحله SDS که خود دارای بار شدید منفی است، سبب‌ ساز منفی شدن بار پروتئین‌ها می‌شود. حال به علت این که به ازای هر دو آمینو اسید، پروتئین‌ها می‌ توانند یک مولکول  SDSرا به خود جذب کنند؛ نسبت بار به جرم پروتئین‌ها یکسان می‌ گردد. بنابراین تنها اندازه مولکول برای میزان حرکت آن تاثیرگذار خواهد بود.

در واقع پروتئومیکس مطالعه و تحقیق غنی، در زمینه پروتئین‌ها می‌ باشد. الکتروفورز دو بعدی بسیار موثر خواهد بود. پروتئومیکس یک موضوع بین رشته‌ای محبوب در میان پژوهشگران می‌ باشد که از اطلاعات ژنتیکی پروژه ژنوم استفاده زیادی کرده است. در پروتئومیکس کمی که به وسیله نرم افزارها صورت می‌پذیرد؛ پروتئین‌ها به صورت جداگانه و همچنین فاصله بین نقاط آنها به خوبی نمایان می‌ شود. در واقع در ژل الکتروفورز به کار رفته در پدید الکتروفورز دو بعدی، جزو اصلی تکنیک پروتئومیکس می‌ باشد. الکتروفورز دو بعدی به واقع، نوعی ژل برای آنالیز پروتئین‌ها می‌ باشد. لازم به ذکر است که بعد از ژنومیکس و ترانسکریپتومیکس ، پروتئومیکس گام بعدی بررسی سیستم های بیولوژیک می باشد. پروتئومیکس بسیار پیچیده‌تر از عنوان‌های قبلی می‌ باشد. این امر به علت این است که پروتئوم در زمان‌های مختلف و در سلول‌های مختلف، متفاوت می‌ باشد.

روش اوفارل الکتروفورز دو بعدی، یکی از روش‌های معمول الکتروفورز دو بعدی می‌ باشد. پس از آماده کردن نمونه با استفاده از روش IEF، نمونه در ظرف پر تیوب ژل الکتروفورز ریخته می‌ شود. پس از پایان فرایند IEF، باید ژل درون لوله با فشار آب مقطر به بیرون هدایت شود. پس از این مرحله باید ژل به مدت بیست تا بیست و پنج دقیقه، در دمای اتاق و در بافر متعادل‌کننده قرار می‌گیرد. در واقع این بافر مشابه بافر نمونه در SDS-PAGE می‌باشد. شایان ذکر است که برای تهیه این مورد کافی است که،بافر ژل، گلیسرول، دی تیو تریتول در ظرفی مخلوط شوند. به کمک آب مقطر باید حجم مخلوط تهیه شده به ۵۰ میلی لیتر برسد. سپس ژل لوله‌ای را روی ژل عمودی قرار می‌دهند. باید توجه شود که در حد فاصل شیشه روی ژل متراکم کننده باید، ژل لوله‌ای قرار گیرد. برای اتصال کامل و به وجود نیامدن حباب، می‌توان از محلول آگارز استفاده کرد. در انتها لازم است که ژل از قالب شیشه خارج شود و به دقت رنگ آمیزی شود.

برای تشخیص پروتئین‌ها از یکدیگر، نیاز به رنگ آمیزی ژن‌ها می‌ باشد. برای رنگ آمیزی ژن‌های دو بعدی، روش‌های متعددی وجود دارد. از جمله مهمترین این روش‌ها رنگ آمیزی فلورسانس، رنگ آمیزی نقره، رنگ آمیزی معکوس و رنگ آمیزی با رنگ‌های آلی می‌باشد. در واقع به کمک رنگ آمیزی ژل‌ها،یک نقشه دو بعدی از پروتئین‌ها به وجود می‌آید. توان منحصر به فرد در روش الکتروفورز دو بعدی برای جداسازی هزاران پروتئین نسبت سایر روش‌ها، اثربخشی و نگاه ویژه به خود را به وجود آورده است. نکته قابل توجه، قابل اندازه‌گیری بودن این تعداد، توسط تحلیل کامپیوتری می‌باشد.